利什曼虫Elisa试剂盒
（美国CORTEZ原装进口  货号：8203-35）

【预期用途】
    利什曼虫ELISA试剂盒可用于定性筛选血清中的内脏利什曼原虫IgG抗体 。

【摘要与解释】
利什曼虫是一种影响了世界上数百万人口的普遍疾病。从全球范围来看，利什曼虫已经成为一种遍布各大洲严重的感染病，尤其是欧洲，印度，亚洲，非洲和中东地区。内脏利什曼病，又称为黑热病，是通过被感染的白蛉叮咬传播给人类的，这种白蛉寄生于杜氏利什曼虫复合体。当白蛉与接触感染对象（比如狗）接触后就成为利什曼虫的宿主了。由于内脏利什曼虫攻击肝脾等内脏系统以及免疫系统，通常利什曼虫已与AIDS感染密切相关。内脏利什曼原虫是一种高死亡率的严重疾病。
几种测试方法已用于诊断急性内脏利什曼病。例如，间接荧光免疫抗体测试（IFAT)和直接凝集实验（DAT）是实践中的两个血清学诊断方法，这是因为抗利什曼虫抗体的滴度在急性阶段通常很高。另一个不太成功的方法是骨髓穿刺。这种方法不仅痛苦和危险，而且成功率也不高。另外，ELISA方法是最受欢迎的血清学诊断方法，有时会与IFAT和DAT结合使用。

【实验原理】
利什曼虫的ELISA试验原理是一个三步温育过程，即第一次温育涉及利什曼虫抗原在ELISA板孔上的包被。在这一步中，任何与抗原反应的抗体都会结合到板孔中。然后，洗净板孔除去测试样品。随后加入酶标记物。在第二次温育时，酶标记物将与任何存在的抗体结合。在第三次温育前，需要充分洗涤板孔。然后加入显色剂四甲基联苯胺（TMB)。酶标记物催化过氧化氢的氧化反应，显色剂变为蓝色。加入终止液后蓝色会变为明亮的黄色。反应即终止。可用酶标分析仪读取实验结果。

【样品收集和准备】
1. 凝血及分离的血清。如果不能立即使用，则需要将样品冻存于-20ºC甚至更低的环境下。
2. 不要加热灭活血清。
3. 避免反复冻融样品。

【试剂盒成分】
1. ELISA板：包被了利什曼虫抗原的微量滴定板,96孔式。
2. 酶标记物：1×11ml/瓶，含硫柳泵稳定缓冲液的辣根过氧化物酶（HRP)。
3. 阳性质控：1×1ml/瓶，含硫柳泵缓冲液的稀释利什曼虫阳性人血清。
4. 阴性质控：1×1ml/瓶，含硫柳泵缓冲液的稀释利什曼虫阴性人血清。
5. TMB底物溶液：1×11ml/瓶，TMB显色剂。
6. 浓缩洗涤液20X：1×25ml/瓶，浓缩缓冲液和表面活性剂。
7. 稀释缓冲液：2×30ml/瓶，缓冲蛋白溶液。
8. 终止液：1×11ml/瓶，浓度为1mol/L的磷酸。

【试验需要但未提供的设备】
  1. 移液管
  2. 洗涤板条用的挤压瓶
  3. 去离子水
  4. 带有450nm和620-650nm波长滤光片的酶标分析仪（可选目测读取结果）
  5. 血清稀释用试管

【试剂的准备】
洗涤缓冲液：打开试剂瓶，在其中加入475ml去离子水，之后将稀释好的洗涤缓冲液倒入挤压瓶。
注意：每孔都加满洗涤液，震荡甩去后再加满。洗涤过程中孔内避免产生气泡。
测试样品：用稀释缓冲液按照1：40的比例稀释病人血清。

【实验步骤】
1. 根据待测样品数量加上2个质控品决定所需的板条数，并将其放置在托架上。
2. 加入100µl的阴性质控至1号孔，100µl的阳性质控至2号孔，以及将100µl稀释过的样品（1：40）溶液加入到剩下的孔中。
（注意：阴性及阳性质控品是预稀释过的，请勿进一步稀释）
3. 在室温（15-25℃）下温育10分钟。
4. 震荡甩出洗涤液，并用稀释过的洗涤缓冲液清洗三次。
5. 每孔加入2滴酶标物。
6. 室温下温育10分钟。
7. 震荡甩出洗涤液，并用洗涤缓冲液清洗三次。
8. 每孔加入2滴显色剂。
9. 在室温下温育5分钟。
10. 加入2滴终止液，轻敲ELISA板使孔内溶液混合。
11. 对空气读数调零后读取450nm处的OD值（参考波长620-650nm）

洗涤包括用稀释的洗涤缓冲液填充每一个板孔，震荡甩出内容物后重复此操作三次。洗涤过程中孔内避免产生气泡。
每次使用试剂盒进行实验时，都需要使用质控品。

【结果说明】
分光光度计：于波长450nm（620-650nm）处读取各孔的OD值。
阳性：OD值大于或等于0.2。
阴性：OD值小于0.2。
目测：如果反应液所显示的颜色很明显，则样品应当被视为阳性。


【性能特点】
    敏感度：30/31=97%
    特异性：53/63=84%

【存储】
试剂，板条和瓶装物应置于2-8ºC。
含有稀释洗涤缓冲液的挤压瓶应置于室温下。