小鼠　CCL8/MCP-2 ELISA 检测试剂盒
（日本IBL 进口原装货号：27773 规格：96T）
 

简介
趋化因子(C-C motif)配体8/单核细胞趋化因子2(CCL8/MCP-2)由97个氨基酸组成，属于C-C亚族．CCL8/MCP-2由单核细胞，纤维母细胞和上皮细胞产生，
对CD4+ T细胞，CD8+ T细胞和NK细胞具有趋化活性．尽管CCL8/MCP-2在小鼠体内的生物活性仍存在未知之数，但近期有报告表明，血浆中CCL8/MCP-2浓度上升与移植物抗宿主病(GVHD)的发病有密切联系，这种病症是一种骨髓移植并发症，并且研究表明CCL8/MCP-2与小鼠机体内的免疫反应息息相关．
 
实验原理
此试剂盒是一种夹心法的酶联免疫吸附测定试剂盒，使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂，最终溶液所显示的颜色强度与小鼠样品中CCL8/MCP-2的量成正比
 
检测范围
78.13 ～5,000 pg/mL
 
预期用途
仅用于研究，不可用于诊断
此试剂盒可用于小鼠血清，EDTA血浆和肝素血浆中CCL8/MCP-的定量检测
 
试剂盒成分

1. 包被板，包被了抗小鼠CCL8/MCP-2(81)兔IgG　　　　　　　　　　96孔
2. 标记抗体，

30X浓缩，HRP标记抗小鼠CCL8/MCP-2兔IgG单抗，Fab'亲合纯化　0.4ml x 1

1. 标准品，重组小鼠CCL8/MCP-2　　　　　　　　　　　　　　　　0.5mlx 2
2. EIA缓冲液，1%的BSA，含0.05%的吐温20的PBS　　　　　　　30mlx 1
3. 标记抗体稀释液，1%的BSA，含0.05%的吐温20的PBS　　　　　12mlx 1
4. 显色剂，TMB，　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　15mlx 1
5. 终止液，1N硫酸，　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12mlx 1
6. 洗涤缓冲浓缩液，40X浓缩，0.005%吐温20的磷酸缓冲液　　　　　50mlx 1

 
实验所需材料但试剂盒未提供
酶标仪（450nm）　　　　　　移液器和枪头
带刻度的量筒和烧杯　　　　　去离子水
冰箱（4℃）　　　　　　　　　坐标纸（对数/对数）
吸水纸　　　　　　　　　　　标准品稀释试管
保温箱（37±1℃）　　　　　　洗瓶
一次性试管
 
试剂准备

1. 洗涤缓冲液制备：试剂盒的洗涤液为40倍浓缩，使用前，先将洗涤浓缩液平衡至室温，充分混匀，然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀，即得。配制的稀释洗涤液应保存于冰箱内，并于2周内用完
2. 稀释标记抗体的制备：用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍，即得。

例：如果只测一条板，8孔，则需要标记抗体800ul（30ul的浓缩标记抗体+870ul的标记抗体稀释液，混匀，使用时每孔加100ul）
此步骤在实验开始前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内，保存在4℃

1. 标准品的制备：吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内，充分混匀，得到浓度为10,000 pg/mL的小鼠CCL8/MCP-2标准品
2. 标准品的稀释：准备8个试管用于标准品的稀释，每管加入230ul的EIA缓冲液

每管的浓度如下
1号管                 5,000 pg/mL
2号管                 2,500 pg/mL
3号管                 1,250 pg/mL
4号管                 625 pg/mL
5号管                 312.5 pg/mL
6号管                 156.25 pg/mL
7号管                 78.13 pg/mL
8号管                 0ng/ml（试验样品空白）
吸取230ul的浓度为10,000 pg/mL的标准品至1号管混匀，然后从1号管吸取230ul加入2号管，依次连续稀释，标准品范围为78.13－5,000 pg/mL .8号管为浓度为0 pg/mL

 

1. 样品稀释：样品如需稀释，请用EIA缓冲液稀释，一般情况下，正常小鼠的血清和血浆样品，建议大概稀释倍数为200－500倍．然而，稀释率应视各实验室具体情况优化，因为小鼠CCL8/MCP-2随个体免疫状态和品种等的不同而不同．

 
实验步骤
使用前，所有样品应平衡至室温，大约30min，然后充分混匀，确保试剂质量无变化，标准曲线和样品检测同时进行

试剂	样品	标准品	样品空白	试剂空白
	检测样品100ul	稀释标准品（1-7管）100ul	EIA缓冲液（第8管）100ul	EIA缓冲液100ul
盖板，37℃下温育60min
洗板7次
酶标抗体	100ul	100ul	100ul	-
盖板，4℃下温育30min
洗板9次
显色剂	100ul	100ul	100ul	100ul
室温避光温育30min
终止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加终止液后30min内于450nm处读取OD值

• 设试剂空白对照孔，并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
• 确定好样品空白孔，样品孔和标准品孔，然后分别将100ul样品空白(8号管)、检测样品和稀释好的标准品(1-7号管)加入到相应的微孔中。
• 盖板，37℃下温育60min
• 用洗瓶剧烈洗板，再在微孔中加入洗涤液静置15－30秒，洒弃洗涤液。重复7次，最后在吸水纸上拍干

如果用自动洗板机洗板，先自动洗板4次，再按上述手动洗板3次

• 每孔加100ul稀释标记抗体，除试剂空白对照孔外
• 盖板，4℃下温育60min
• 按照步骤4）洗板9次
• 取所需量的显色剂加入到试管中，然后在每一微孔中加入100ul显色剂。

为了避免污染，请勿将剩余试剂在倒入原装试剂瓶中。

• 室温避光温育30min，加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
• 在每孔加100ul终止液，轻敲板边混匀，此时溶液颜色会变成黄色
• 擦去微孔板底部的污垢或水滴并确定反应液无气泡产生，加终止液后30min内在酶标仪450nm处读数

 
特别注意

1. 试验样品采集后应立即检测或是冻存，冻存的样品避免反复冻融，检测前应在低温下先将其完全溶解混匀
2. 试验样品用EIA缓冲液稀释
3. 试验样品和标准品建议做双份检测
4. 试验样品应在中性PH范围，有机溶剂的污染可能会影响检测结果
5. 只能用试剂盒提供的洗涤液洗板，不充足或过多的洗涤会导致试验失败
6. 吸水纸上拍干微孔板，不能擦拭
7. TMB底物液应贮存于黑暗处，因其对光敏感，且避免接触金属
8. 加入终止液后30min内必须于酶标仪读数

 
结果计算
绘制曲线前，所有的数据都应减去试验样品空白值，包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线，从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度

 
以上典型标准曲线仅供演示说明用，不能用于试验数据的获取，每次试验都应建立标准曲线
 
本译文仅供参考，详情请以原文为准。
 
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