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人细胞毒素相关蛋白A (CagA)检测试剂盒
人阅读 发布时间:2012-10-17 08:54
人细胞毒素相关蛋白A (CagA)检测试剂盒
(美国DRG进口原装,货号:EIA 4138)
美国DRG中国独家代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务
酶联检测人血清或血浆中抗CagA IgG抗体
实验原理此试剂盒基于酶联免疫法,采用HRP酶联物;第一次孵育中,样本中的抗CagA IgG 抗体与包被的CagA 抗原结合,洗板除去未结合的,再次孵育,二抗(过氧化物酶标记的抗人IgG)与CagA-抗原-抗体复合物结合,再次洗板后,无色的显色剂(TMB)底物液加入微孔内,与过氧化物酶反应生成了有颜色的复合物,加入硫酸终止颜色反应,酶标仪450nm和405nm处检测颜色强度,标准品和样本中的抗CagA IgG 抗体浓度与颜色强度成正比
试剂盒组成
足够用于96人份的试剂
试剂盒贮存于2-8℃
各试剂有效期见试剂瓶标签
试剂盒一旦开封,在2-8℃下可保存2个月
- 【MTP】包被板,96孔,包被有CagA抗原(重组DNA获得),未用的板条保存于密封袋内2-8℃下
- 【CAL】标准品,6瓶,1.5ml/瓶,抗CagA IgG 血清基质,浓度为0;15;30;60;120;240 RU/ml,即用,红色,叠氮化钠(<0.1%)作为防腐剂
- 【CONJ】酶联物,1瓶,14ml,HRPO标记的小鼠单抗抗人IgG,TRIS 缓冲液,稳定剂,即用,粉色,新霉素作为防腐剂
- 【WASH】洗涤缓冲液(浓缩),1瓶,50ml,PBS-吐温20 ,硫柳汞(<0.05%)作为防腐剂,使用前,用蒸馏水1:20比例稀释;若出现不溶解的晶体,则需在37℃下温育数分钟;稀释的洗涤液可在2-8℃下保存30天
- 【DIL】样本稀释液(浓缩,)1瓶,20ml,血清基质,稳定剂,红色,叠氮化钠(<0.1%)作为防腐剂,使用前以稀释的洗涤液1:20比例稀释;稀释的样本稀释液2-8℃下可保存30天
- 【TMB】显色剂,2瓶,15ml,含柠檬酸-磷酸缓冲液,DMSO和H2O2的TMB,即用
- 【STOP】封闭液,1瓶,14ml,1N的硫酸,即用
- 【CPA】盖板
- 塑料包装袋
实验所需材料但试剂盒未提供
- 带一次性枪头的可调的,自动的微量移液器
- 干燥箱,调节至37±2℃
- 用于试剂稀释的刻度容器
- 抽吸式泵或自动洗板设备
- 酶标仪(450nm和405nm)
- 坐标纸
- 蒸馏水
此实验还可以用自动酶标仪进行操作
样本采集与准备
试验可检测血清或血浆样本
适量的脂血样本不会影响结果,高含量的脂血或溶血样本可能会影响试验,纤维蛋白丝会干扰试验;确保检测前样本是清澈的,样本在2-8℃下可保存1周,想要保存更长时间建议冻存于-20℃,避免反复冻融
使用前:以1:300的比例用先前已稀释的样本稀释液进行样本稀释
(如:10 ul 样本+ 2990 ul的稀释液)
实验步骤
试剂和样本平衡至室温
使用前来回倒置混匀样本
- 准备的微孔:空白,标准品和样本
- 加100 ul 的标准品和先前稀释的样本于相应的微孔内
- 空白孔内加100 ul 的样本稀释液
- 用试剂盒内提供的胶粘纸张盖住包被板,37±2℃下孵育60±5 min
- 350 ul的稀释的洗涤液,洗板4次,吸走微孔内的所有液体
- 每孔加100 ul的酶联物
- 用试剂盒内提供的胶粘纸张盖住包被板,37±2℃下孵育30±2 min
- 按照步骤5)洗板
- 每孔加100 ul的显色剂
- 37±2℃下孵育15 min,避免直射阳光
- 每孔加100 ul的封闭液
- 采用合适的酶标仪在50nm处读取吸收值,参考波长620nm(以空白对照孔校零),万一出现了吸收值溢出,则选择在405nm处读数;试验操作结束15min内必须完成读数
实验操作图
包被孔 | 空白 | 标准品 | 样本 |
试剂 | |||
标准品 | - | 100 ul | - |
稀释的样本 | - | - | 100 ul |
样本稀释液 | 100 ul | - | - |
孵育:37±2 ℃,60±5 min | |||
洗板:4 x 350 ul | |||
酶联物 | 100 ul | 100 ul | 100 ul |
孵育:37±2 ℃,30±2 min | |||
洗板:4 x 350 ul | |||
显色剂 | 100 ul | 100 ul | 100 ul |
孵育:37℃,15 min | |||
封闭液 | 100 ul | 100 ul | 100 ul |
读数:450 nm |
结果计算
线性坐标纸上以标准品的浓度为X轴,吸收值为Y轴,绘制标准曲线;相应的抗-CagA IgG抗体浓度(RU/mL)根据各样本吸收值从标准曲线获得
- 样本IgG 值小于10 RU/mL,则判定为抗CagA IgG 抗体无反应
- 样本IgG 值10 -15 RU/mL,则判定为弱反应
- 样本IgG 值高于15 RU/mL,则判定为抗CagA IgG 抗体有反应
计算示例
以下数值仅供演示示例,不能用于代替实验数值
通过标准曲线得到样本抗CagA IgG 抗体滴度为70 RU/mL
验证标准
结果计算之前,先确保质控吸收值在以下期望值范围内
描述 | 期望值 |
阴性质控 | <0.100 |
OD 值之比(标准品240 RU/mL/标准品15 RU/mL) | >2.5 |
OD 值之比(标准品15 RU/mL/标准品0 RU/mL) | >3.5 |
本译文仅供参考,请以原说明书为准
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